本发明公开了一种金属β-内酰胺酶抑制肽及其应用,属于生物医药领域。该金属β-内酰胺酶抑制肽的氨基酸序列为Cys-Ala-Cys,通过固相合成法可制备得到。本发明的金属β-内酰胺酶抑制肽与β-内酰胺类抗生素联合使用可避免抗生素被酶水解破坏而失效,可应用于制备预防或治疗耐药菌感染疾病的药物。本发明的金属β-内酰胺酶抑制肽具有较强的酶抑制活性,其安全性高,人工合成方便,适合工业化大规模生产,为开发新的抗菌药物提供了新的选择,在治疗耐药菌感染领域具有良好的开发前景。
1.一种金属β-内酰胺酶抑制肽在制备治疗产β-内酰胺酶的耐药菌感染疾病的药物中的应用,其特征在于:所述的金属β-内酰胺酶抑制肽的氨基酸序列为Cys-Ala-Cys。
2.一种抗菌药物组合物,其特征在于:包含权利要求1所述的金属β-内酰胺酶抑制肽。
3.根据权利要求2所述的抗菌药物组合物,其特征在于:还包含所述的金属β-内酰胺酶抑制肽药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。
4.一种抗菌药物组合物,其特征在于:包含权利要求1所述的金属β-内酰胺酶抑制肽和β-内酰胺类抗生素。
5.根据权利要求4所述的抗菌药物组合物,其特征在于:所述的β-内酰胺类抗生素为美罗培南。
6.根据权利要求4所述的抗菌药物组合物,其特征在于:还包括所述的金属β-内酰胺酶抑制肽和β-内酰胺类抗生素药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。
7.根据权利要求2-6任一项所述的抗菌药物组合物,其特征在于:所述的抗菌药物组合物为注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂或霜剂;所述的抗菌药物组合物通过注射、口服、滴鼻或滴眼的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉或粘膜组织,或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种金属β-内酰胺酶抑制肽及其应用。
背景技术
β-内酰胺类抗生素是目前临床上使用最广、疗效最为显著的抗细菌微生物药物之一。抗生素一方面治愈了大量感染疾病的患者,另一方面又加速了菌株的选择,使之耐药。目前公认的细菌耐药机制主要有4种:1产生β-内酰胺酶,灭活β-内酰胺类抗生素;2改变细菌外膜通透性,使抗生素无法进入菌体而发挥抗菌作用;3改变靶标蛋白,使抗生素无法与之结合或降低抗生素对靶标蛋白的亲和力,从而降低抗菌作用。4外排泵机制,通过细菌内膜降低对抗生素的通透性或将其从菌体内泵出,使菌体内抗生素量减少而产生耐药。其中细菌通过产生β-内酰胺酶,水解该类抗生素结构中的β-内酰胺环,从而灭活该类抗生素是细菌产生耐药性的主要原因。按照酶与底物作用的类型来分,可将β-内酰胺酶分为4种类型A,B,C,D,其中A,C,D的活性中心是丝氨酸,B型活性中心含有1-2个金属Zn(II)离子,因此B型β-内酰胺酶又称为金属β-内酰胺酶。目前临床上常用的β-内酰胺酶抑制剂主要有克拉维酸、舒巴坦及他唑巴坦。这些抑制剂与β-内酰胺类抗生素组成的复方制剂在临床上治疗产β-内酰胺酶的耐药菌发挥了巨大的作用,常见的药物组合主要有:阿莫西林/克拉维酸、替卡西林/克拉维酸、阿莫西林/舒巴坦、哌拉西林/舒巴坦、头孢噻肟/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢曲松钠/舒巴坦、美洛西林/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/他唑巴坦。令人遗憾的是,上述抑制剂对金属β-内酰胺酶无抑制活性,前不久引起全球的关注的“NDM-1超级耐药细菌”,也是因其能表达新德里金属β-内酰胺酶-1(NewDelhi-metallo-1,NDM-1)而闻名。目前,尚无上市的该类酶的抑制剂,即便处于研究阶段的,也主要为小分子化合物。
发明内容
本发明的首要目的在于以多药耐药细菌所产生的水解抗生素的酶(金属β-内酰胺酶)为靶标,针对其催化水解破坏抗生素的活性中心设计其小肽抑制剂,提供一种金属β-内酰胺酶抑制肽。本发明的另一目的在于提供上述金属β-内酰胺酶抑制肽的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现:一种金属β-内酰胺酶抑制肽,为3个氨基酸的线性小肽,其氨基酸序列为Cys-Ala-Cys,分子量为296.4,化学结构如下:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>上述金属β-内酰胺酶抑制肽可通过固相合成法制备,方法简单,技术成熟、产物质量容易控制,能满足大规模工业化生产的需要。上述金属β-内酰胺酶抑制肽在抑制金属β-内酰胺酶中的应用。上述金属β-内酰胺酶抑制肽在制备预防或治疗耐药菌感染疾病的药物中的应用。一种抗菌药物组合物,包含所述的金属β-内酰胺酶抑制肽,还包括该抑制肽药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体。所述的金属β-内酰胺酶抑制肽与β-内酰胺类抗生素具有良好的协同作用,能明显抑制耐药菌产金属β-内酰胺酶并且大幅度降低β-内酰胺类抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。一种抗菌药物组合物,包含所述的金属β-内酰胺酶抑制肽和β-内酰胺类抗生素,还包括该抑制肽和β-内酰胺类抗生素药学上可接受的盐和/或药学上可接受的载体;所述的β-内酰胺类抗生素优选为美罗培南。将本发明的抑制肽与抗生素合用能更有效的抑制耐药细菌的生长。通过溶血实验表明,所述的金属β-内酰胺酶抑制肽在浓度高达5mg/mL时未发生明显的溶血反应,其安全性高。上述抗菌药物组合物可以根据药学领域的常规制剂方法制备成注射剂、片剂、注射用无菌粉末、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂等多种剂型。该抗菌药物组合物可以通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉或粘膜组织,或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。本发明具有如下优点与效果:本发明的金属β-内酰胺酶抑制肽具有较强的酶抑制活性,且安全性高;其人工合成方便,生产成本低,适合工业化大规模生产;将该抑制肽与β-内酰胺类抗生素联合使用可避免抗生素被酶水解破坏而失效,在治疗耐药菌感染领域具有良好的开发前景;本发明的金属β-内酰胺酶抑制肽为开发新的抗菌药物提供了新的选择。
附图说明
图1是制备的金属β-内酰胺酶抑制肽的高效液相色谱图。图2是制备的金属β-内酰胺酶抑制肽的质谱图。图3是金属β-内酰胺酶抑制肽对金属β-内酰胺酶抑制活性的测定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1金属β-内酰胺酶抑制肽的制备以9-芴甲氧羰基(FMOC)为N端保护基团,采用固相合成法合成该肽。用90%三氟乙酸、6%水和4%三异丙基硅烷(TIS)的混合液(90%、6%、4%均为质量百分比)将其从MBHA树脂上裂解。乙醚多次沉淀后,经制备型反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化。使用C18反相制备柱(20mm×250mm,5μm);流动相:0.08%三氟乙酸,0%-70%乙腈(0.08%、0%-70%为体积百分比)为流动相,2mL/min的流速进行梯度洗脱。用RP-HPLC测定纯度>95%(图1),冻干备用。经ESI-QTOF-MS鉴定(图2),其分子量与理论分子量一致。实施例2金属β-内酰胺酶抑制肽对金属β-内酰胺酶抑制活性的测定以美罗培南为报告底物,实验分为3组,保持温度为37±1°C:(1)美罗培南+SMB-1型金属β-内酰胺酶组:向10μL浓度为1mmol/L的美罗培南与80μL浓度为50mmol/L的HEPES缓冲液(pH7.0)的混合溶液中加入10μL浓度为1μmol/L的SMB-1型金属β-内酰胺酶(沈秉正等.SMB-1型金属β-内酰胺酶的原核表达及酶活性研究.[J].广东药学院学报,2013,29(4):1-4.),总体积为100μL。(2)美罗培南+SMB-1型金属β-内酰胺酶+酶抑制肽组:向10μL浓度为1mmol/L的美罗培南与70μL浓度为50mmol/L的HEPES缓冲液(pH7.0)的混合溶液中加入10μL浓度为1μmol/L的SMB-1型金属β-内酰胺酶与10μL浓度为1μmol/L的酶抑制肽,总体积为100μL。(3)美罗培南组:向10μL浓度为1mmol/L的美罗培南中加入90μL浓度为50mmol/L的HEPES缓冲液(pH7.0),总体积为100μL。由于底物美罗培南被酶水解后其吸光度下降,因而通过测定波长为300nm的吸光度的变化可以表征底物的水解程度。结果如图3所示,表明(1)组吸光度在600秒内下降最快,说明SMB-1型金属β-内酰胺酶(SMB-1酶)能高效地催化底物美罗培南的水解;(2)组吸光度虽然也有一定程度的降低,但相对与(1)组,其下降的程度及速率要缓慢得多,说明本发明的金属β-内酰胺酶抑制肽具有明显的抑制作用;(3)组为阴性对照,吸光在整个过程中基本无变化,说明底物美罗培南的水解是金属β-内酰胺酶催化的,与酶促反应体系中缓冲液等物质无关。实施例3金属β-内酰胺酶抑制肽与β内酰胺类抗生素协同抗菌作用测定为了能够安全进行协同抗菌实验,使用相对安全的基因工程菌E.colixa0BL21(DE3)-pET28a-SMB-1菌株(沈秉正等.SMB-1型金属β-内酰胺酶的原核表达及酶活性研究.[J].广东药学院学报,2013,29(4):1-4.)作为耐药菌株,将E.colixa0BL21(DE3)菌株作为阴性对照。采用二倍稀释法测定最小抑菌浓度(Minimumxa0Inhibitoryxa0Concentration,MIC),通过MIC值的变化反应抑制肽与抗生素的协同抗菌作用。具体方法如下:将超低温冰箱中保存的能表达金属β-内酰胺酶的工程菌菌株E.colixa0BL21(DE3)-pET28a-SMB-1(耐药菌)以及对照菌株E.colixa0BL21(DE3)分别接种于灭菌的Luria-Bertani(LB)固体培养基中,于37°C恒温培养箱中倒置培养12小时。用接种环挑取单菌落分别转接到灭菌的液体LB培养基中,于37°C,200rpm条件下在震荡培养至对数生长期。用紫外分光光度计测定600nm波长处菌液的吸光度值(OD₆₀₀),根据1OD=1×10⁹CFU/mL的换算关系,分别将表达金属β-内酰胺酶的工程菌菌株以及对照菌株稀释至2×10⁵CFU/mL。在无菌96孔板中先加入100μL灭菌的LB培养基。对照组(1)使用E.colixa0BL21(DE3)菌。首先在无菌96孔板中先加入100μL灭菌的LB培养基;接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为1024μg/mL抗生素美罗培南加溶液100μL入到第1孔中,混合均匀后取100μL加入第2孔中,依次倍比稀释,从第12孔吸出100μL弃去;最后向各孔中加入稀释好的菌液100μL,混合均匀。对照组(2)使用E.colixa0BL21(DE3)菌。首先在无菌96板中先加入含有经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为200μmol/L抑制肽灭菌的LB培养基100μL;接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为1024μg/mL抗生素美罗培南加溶液100μL入到第1孔中,混合均匀后取100μL加入第2孔中,依次倍比稀释,从第12孔吸出100μL弃去;最后向各孔中加入稀释好的菌液100μL,混合均匀。对照组(3)使用工程菌E.colixa0BL21(DE3)-pET28a-SMB-1。首先在无菌96孔板中先加入100μL灭菌的LB培养基;接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为1024μg/mL抗生素美罗培南加溶液100μL入到第1孔中,混合均匀后取100μL加入第2孔中,依次倍比稀释,从第12孔吸出100μL弃去;最后向各孔中加入稀释好的菌液100μL,混合均匀。对照组(4)使用工程菌E.colixa0BL21(DE3)-pET28a-SMB-1。首先在无菌96孔板中先加入100μL灭菌的LB培养基;接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为200μmol/L抑制肽溶液100μL加入到第1孔中,混合均匀后取100μL加入第2孔中,依次倍比稀释,从第12孔吸出100μL弃去;最后向各孔中加入稀释好的菌液100μL,混合均匀。实验组均使用能表达金属β-内酰胺酶的工程菌E.colixa0BL21(DE3)-pET28a-SMB-1。实验组(1)首先在无菌96板中先加入含有经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为200μmol/L抑制肽灭菌的LB培养基100μL;接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为1024μg/mL抗生素美罗培南溶液100μL加入到第1孔中,混合均匀后取100μL加入第2孔中,依次倍比稀释,从第12孔吸出100μL弃去;最后向各孔中加入稀释好的菌液100μL,混合均匀。实验组(2)首先在无菌96孔板中先加入含有经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为100μmol/L抑制肽灭菌的LB培养基100μL;接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为1024μg/mL抗生素美罗培南溶液100μL加入到第1孔中,混合均匀后取100μL加入第2孔中,依次倍比稀释,从第12孔吸出100μL弃去;最后向各孔中加入稀释好的菌液100μL,混合均匀。实验组(3)首先在无菌96孔板中先加入含有经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为50μmol/L抑制肽灭菌的LB培养基100μL;接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为1024μg/mL抗生素美罗培南溶液100μL加入到第1孔中,混合均匀后取100μL加入第2孔中,依次倍比稀释,从第12孔吸出100μL弃去;最后向各孔中加入稀释好的菌液100μL,混合均匀。实验组(4)首先在无菌96孔板中先加入含有经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为25μmol/L抑制肽灭菌的LB培养基100μL;接下来将经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的浓度为1024μg/mL抗生素美罗培南溶液100μL加入到第1孔中,混合均匀后取100μL加入第2孔中,依次倍比稀释,从第12孔吸出100μL弃去;最后向各孔中加入稀释好的菌液100μL,混合均匀。以上各组于37°C震荡培养18小时,测定波长为600nm处的吸光度值。最小抑菌浓度(MIC)取检测不到不到细菌生长的孔中美罗培南终浓度的最低值,结果如表1。表1金属β-内酰胺酶抑制肽与β内酰胺类抗生素协同抗菌作用测定结果ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>—^a:对照组(4)的实验体系中含有耐药菌菌液、酶抑制肽,不含抗生素美罗培南,因而无MIC数据。由表1结果可知,对照组(1)、(2)中美罗培南对不耐药的菌株E.colixa0BL21(DE3)具有良好的抑制作用(MIC=2μg/mL);对照组(1)与对照组(2)的MIC相同,说明金属β内酰胺酶抑制肽本身并无抑制细菌生长的作用;对照组(3)为耐药菌株E.colixa0BL21(DE3)-pET28a-SMB-1,美罗培南对其生长的抑制作用较弱(MIC=256μg/mL),同时也证明了该菌株为耐药菌;对照组4中含有终浓度为50μmol/L的酶抑制肽而不含抗生素美罗培南,培养18小时后菌液十分浑浊,在600nm处的吸光度OD₆₀₀=4.4,进一步证明该酶抑制肽本身无抗菌作用。从实验组的MIC可以看出,当酶抑制肽与抗生素美罗培南联合使用时,通过协同作用能明显提高美罗培南的抗菌活性,特别是实验组(2)当酶抑制肽浓度C_肽=25μmol/L时,美罗培南的抗菌活性(MIC值)提高了4倍(256μg/mL÷64μg/mL=4)。实施例4金属β-内酰胺酶抑制肽溶血活性(HC₅₀)的测定采集人静脉血,将所采集的血液与阿氏液(Alseverxa0Solution,葡萄糖20.5g、柠檬酸钠8.0g、柠檬酸0.5g、氯化钠4.2g,加蒸馏水值1000mL。混合后加热溶化,115°C灭菌10分钟,4°C保存)按1:1(体积比)比例混合置于离心管中,800rpm离心6分钟,用灭菌生理盐水洗涤至上清液无色。将上述洗涤好的红细胞悬浮于pH值为7.4的0.01mmol/Lxa0PBS缓冲液中,制备红细胞悬浮液(5%v/v)。将酶抑制肽溶解于PBS缓冲液中,配成浓度为10mg/mL的储备液,取10只1mL灭菌的Eppendorf管并编号,首先在2-10管中加入0.5mLxa0PBS缓冲液,第1管、第2管加入0.5mL抑制肽储备液;然后将第2管中的溶液混匀后吸取0.5mL至第3管中并混匀,依次倍比稀释;最后从第10管中吸出0.5mL弃去。补加0.5mL配好的5%人血红细胞悬浮液至终体积为1mL,轻轻混匀,于37°C恒温培养箱中保温60分钟,3000rpm离心12分钟,取上清液在415nm波长处测定吸光度,进行比色。以红细胞悬浮于PBS缓冲液中为阴性对照;以红细胞悬浮于1%TritonX-100(1%为体积百分比)中为阳性对照。HC₅₀为用溶血百分率为50%时的金属酶抑制肽浓度表示,即HC₅₀为半数溶血量。溶血百分率用以下公式计算:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>结果表明,本发明的金属β-内酰胺酶抑制肽在本实验所达到的最高浓度5mg/mL时未见溶血。实施例5取本发明的金属β-内酰胺酶抑制肽(Cys-Ala-Cys)0.2g,淀粉3g,糊精1.5g混合,质量浓度为35%的药用级聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为粘合剂,制粒,压片,既得片剂。实施例6取的金属β-内酰胺酶抑制肽Cys-Ala-Cys)0.5g,甘露醇8g,置于容器中,加适量磷酸盐缓冲液(0.05mol/Lxa0pH8.0)溶解,加注射用水至100mL,摇匀,加1~5g针用活性炭,室温搅拌30~60分钟,粗滤,用0.22μm滤膜过滤除菌,分装,每瓶1mL,采用速冻的方法,每分钟降温5~15°C,降温至-50°C,维持2小时,抽真空,在真空状态下缓慢升温,升温速度每小时0.2~12°C,温度升至30°C时停止升温,待温度降至室温后取出,加盖密封,既得冻干粉针剂。上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。